Terapia in vivo pentru repararea prenatală a mielomeningocelului în modelul fetal ovin cu celule stem mezenchimale umane derivate din cordonul ombilical: dovadă de principiu, rezumatul studiului

Puncte principale și rezultate:

Acesta este un studiu pe miei nenăscuți. Niciun om nu a fost tratat. O echipă de la University Medical Center Hamburg-Eppendorf din Germania a creat un defect de tip spina bifida (mielomeningocel) în coloana unor miei fetali și apoi l-a reparat în uter, așa cum fac chirurgii în chirurgia fetală la om. La unii miei au aplicat mai întâi celule stem mezenchimale (MSC) umane din cordonul ombilical direct pe măduva spinării expusă. Celulele au provenit din Desacell, un produs gata de folosire, obținut din țesutul cordonului ombilical al unui singur nou-născut sănătos. Studiile anterioare pe oi folosiseră celule însămânțate pe un plasture, așa că acesta a fost primul raport despre aplicarea în acest mod a unei suspensii lichide de celule.

Studiul a arătat că celulele au putut fi aplicate la toți cei cinci miei care trebuiau să le primească. Nu a putut arăta dacă celulele au ajutat. Doar trei dintre cei șapte miei operați s-au născut vii (doi tratați, unul netratat), toți trei au avut scoruri de mișcare normale sau aproape normale, iar mielul netratat a avut de fapt cea mai mare densitate de celule nervoase mari supraviețuitoare. Autorii înșiși spun că eșantionul a fost prea mic pentru orice comparație între grupuri.

Scop:

Scopul principal a fost testarea posibilității de a aplica local un produs gata de folosire cu MSC umane din cordonul ombilical (Desacell) pe măduva spinării în timpul reparării fetale a spinei bifida la oi. Scopurile secundare au fost să se vadă dacă celulele îmbunătățesc mișcarea pe scala Sheep Locomotor Rating (SLR), dacă cresc mărimea măduvei spinării și a substanței ei cenușii și dacă densitatea celulelor nervoase mari se corelează cu mișcarea.

Metode:

Au fost folosite oi gestante de la un singur crescător, toate purtând miei de la același berbec. Studiul a fost aprobat de autoritatea landului Hamburg conform Legii germane privind protecția animalelor.

La aproximativ 75 de zile de gestație (gestația la oaie durează aproximativ 145 de zile), chirurgii au deschis uterul, au îndepărtat pielea, mușchii spatelui și arcurile osoase ale coloanei de la L1 la L5 și au deschis membrana care acoperă măduva spinării. Astfel, măduva rămâne expusă lichidului amniotic, imitând spina bifida. Aproximativ 25 de zile mai târziu, mieii au avut o a doua operație pentru repararea defectului. Mieii au fost repartizați în raport de doi la unu la reparare cu sau fără celule. În grupul cu celule, țesutul cicatricial de pe măduva spinării a fost curățat și s-a aplicat direct pe măduvă 1 mL de suspensie-gel Desacell cu 30 de milioane de celule. Toți mieii au primit apoi un plasture multistrat și închiderea pielii. În sarcinile gemelare, un geamăn a fost tratat, iar celălalt a servit drept control sau nu a fost operat.

Celulele au provenit dintr-un singur cordon ombilical de la donator, au îndeplinit criteriile internaționale de identitate pentru MSC și au fost testate pentru sterilitate, micoplasme și endotoxine. Au fost decongelate, spălate, numărate și transportate refrigerat (4 °C) la locul operației.

Mieii s-au născut la termen și au fost filmați la 2 și la 48 de ore după naștere. Evaluatori care nu știau ce miei primiseră celule au notat mișcarea pe scala SLR de 15 puncte, unde 15 înseamnă mers normal, iar 0-4 afectare severă. Mieii au fost apoi eutanasiați, iar măduva spinării lombare a fost tăiată în cinci până la opt segmente, colorată și măsurată. Un neuropatolog, de asemenea fără să cunoască grupurile, a numărat celulele nervoase motorii mari pe milimetru pătrat de substanță cenușie. Înainte de studiu, autorii au calculat că grupuri de trei și șase miei ar oferi o putere statistică de doar 25,5%, ceea ce înseamnă că o diferență reală ar fi foarte probabil ratată.

Rezultate:

Supraviețuire: Defectele au fost create la 11 miei fetali, la o medie de 76,9 zile.

• Trei au fost pierduți după prima operație. O oaie a dezvoltat o dehiscență a plăgii cu ocluzie intestinală și a fost eutanasiată, un făt a murit după ce oaia a avut febră, iar unul a murit în ziua unei complicații a plăgii.
• La încă un miel, fătul nu a putut fi accesat chirurgical, așa că șapte miei au fost operați, la o medie de 104,3 zile. Cinci au primit celule, iar doi nu.
• Alți patru fetuși au murit la 11-17 zile după reparare: trei dintre cei cinci miei tratați și unul dintre cei doi netratați. Unul avea un abces fungic la nivelul coloanei, cu infecție fungică generalizată. Cauza celorlalte decese a fost neclară.
• Trei miei s-au născut vii la 144-147 de zile: mielul 1 (fără celule) și mieii 3 și 4 (cu celule). Articolul indică o rată totală de nașteri vii de 30%.

Mișcare (scala SLR, din 15):

• Mielul 1 (fără celule) a avut scorul 15 la 2 ore și 15 la 48 de ore.
• Mielul 3 (cu celule) a avut scorul 13 la 2 ore și 15 la 48 de ore.
• Mielul 4 (cu celule) a avut scorul 15 la 2 ore și 15 la 48 de ore.

Prin urmare, toți cei trei miei mergeau normal la 48 de ore, indiferent dacă primiseră sau nu celule, așa că scorurile nu au putut arăta niciun beneficiu.

Țesutul măduvei spinării: Nu s-a observat nicio tumoră la niciun miel, nici cu ochiul liber, nici la microscop.

• Densitatea medie a celulelor nervoase mari a fost de 20,4 pe mm² la mielul netratat, față de 15 și 13,1 pe mm² la cei doi miei tratați. Autorii notează că este opusul a ceea ce au găsit studiile anterioare.
• Aria medie a substanței cenușii a fost mai mare la mieii tratați (274 și 218 unități, față de 171 la mielul netratat), iar proporția din măduvă reprezentată de substanța cenușie a fost de 0,32 și 0,48, față de 0,31. Autorii sugerează că acest lucru „ar putea indica o mai bună păstrare a țesutului”.
• Ariile au fost măsurate în pixeli de imagine și nu au fost raportate teste statistice de comparație între miei.

Concluzii:

Autorii concluzionează că aplicarea unui produs cu MSC umane din cordonul ombilical în timpul reparării fetale a spinei bifida la oi este fezabilă și că sunt necesare studii mai mari cu Desacell pentru a testa mișcarea, protecția nervoasă și siguranța.

Studiul este un prim pas tehnic. Au putut fi evaluați doar un miel netratat și doi tratați, așa că rezultatele nu pot arăta dacă celulele funcționează. Autorii enumeră trei limite principale: rata mare a deceselor fetale, care a eliminat orice șansă a unei comparații relevante și poate reflecta probleme chirurgicale fără legătură cu celulele; lipsa unor colorații speciale (imunohistochimie), așa că nu au putut confirma că celulele erau încă prezente în zona reparată; și prea puțini supraviețuitori pentru ca scorurile de mișcare să aibă vreo semnificație. În plus, mielul netratat mergea normal, ceea ce sugerează că defectul din acest model nu a provocat o slăbiciune durabilă la aceste animale, iar cu un singur miel pe comparație, diferențele de substanță cenușie și de celule nervoase ar putea ține ușor de întâmplare. Rezultatele pe termen lung, cum ar fi funcția vezicii urinare sau măduva fixată, nu au fost studiate, deoarece mieii au fost examinați doar până la 48 de ore după naștere.

Informații de fond:

Spina bifida afectează aproximativ 1 din 2.000 de sarcini în Europa. Studiul MOMS a arătat că repararea defectului înainte de naștere reduce la jumătate nevoia unui șunt pentru lichidul cefalorahidian și dublează șansa de a merge la 30 de luni, dar 58% dintre copiii operați înainte de naștere tot nu pot merge independent. Cercetătorii speră că adăugarea celulelor stem în momentul reparării ar putea proteja suplimentar măduva spinării expusă.

Produsul celular Desacell este descris ca un produs gata de folosire, obținut printr-un protocol de izolare brevetat. Articolul nu numește producătorul sau deținătorul brevetului. Autorii afirmă că a fost testat la rozătoare și la babuini prematuri, la adulți cu insuficiență pulmonară severă (CIRCA-19), la bebeluși prematuri cu risc de boală pulmonară cronică (HULC-1) și că este studiat la adulți cu șoc septic (UC-CISS II). Studiul pe babuini pe care îl citează, condus de coautorul Möbius, are titlul „Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates”. Doi dintre autori sunt de la Saxonian Center for Feto/Neonatal Health de la Technische Universität Dresden.

Studiul a fost finanțat de Fundația Germană pentru Cercetare (DFG BA 7308/4-1). Autorii declară că nu au conflicte de interese. Lucrarea este doar un experiment pe animale, iar autorii indică studiul CuRe în desfășurare, care folosește celule placentare pe un plasture, ca primul studiu la om cu celule stem administrate în timpul reparării fetale a spinei bifida.