Celulele stromale mezenchimale imunomodulatoare derivate din amnios păstrează funcția musculară într-un model murin de distrofie musculară Duchenne

Puncte principale și constatări:

Acesta este un studiu pe animale. Nu a fost tratat niciun pacient. O echipă japoneză de la Universitatea din Tokyo, Nippon Medical School și Kaneka Corporation a administrat celule stromale mezenchimale derivate din amnios uman (hAMSC) la șoareci mdx, modelul murin standard al distrofiei musculare Duchenne, prin injecții repetate în vena din coadă, și a urmărit șoarecii până la un an.

Pentru o familie care ia în calcul un tratament, lucrarea arată că aceste celule calmează sistemul imunitar în laborator, împingând macrofagele spre tipul antiinflamator M2, că dozele intravenoase repetate au fost tolerate de șoareci și au redus inflamația musculară, și că șoarecii tratați au păstrat mai multă forță de prindere, au alergat mai departe și au avut o funcție cardiacă puțin mai bună la un an. Ea nu arată că vreunul dintre aceste lucruri se întâmplă la copii. Celulele erau derivate din amnios, nu din cordon ombilical, ca cele folosite în programul nostru, și nu au refăcut distrofina, proteina lipsă care cauzează boala. Celulele au fost furnizate de Kaneka Corporation, care a finanțat parțial lucrarea și angajează patru dintre autori.

Scop:

Testarea dacă hAMSC polarizează macrofagele umane spre tipul M2 și dacă injecția sistemică repetată de hAMSC, administrată devreme în boală, îmbunătățește funcția mușchiului scheletic și a celui cardiac la șoareci mdx.

Metode:

Celule. Amniosul a fost luat, cu consimțământ, din membranele fetale ale unor femei care au născut prin cezariană. Celulele au fost izolate prin digestie enzimatică, expandate, congelate și folosite între pasajele 1 și 5. Ele purtau markerii obișnuiți ai MSC (CD73, CD90, CD105), nu aveau CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 și HLA-DR și au format os și cartilaj în cultură, dar nu grăsime.

Lucrări de laborator. Celule mononucleare din sânge uman au fost cocultivate cu hAMSC în raport de 20 la 1, iar markerii macrofagelor au fost măsurați prin citometrie în flux și qPCR, folosind indometacin pentru a bloca prostaglandina E2 (PGE2).

Animale. Șoareci mdx de sex masculin, pe fond C57BL/10, au fost împărțiți randomizat în grupuri de control și tratate. Fiecare doză a fost de 8,0 × 10⁵ hAMSC în 100 µL de soluție salină, în vena din coadă, o dată pe săptămână, începând la vârsta de 4 până la 5 săptămâni. Brațul pe termen scurt a primit patru doze (n = 10, evaluat la vârsta de 12 și 18 săptămâni, față de 14 șoareci mdx de control și 7 de tip sălbatic). Brațul pe termen lung a primit patru doze (n = 6) sau șase doze (n = 4) și a fost evaluat la un an, față de 12 șoareci mdx de control și 7 de tip sălbatic. Multe rezultate au fost măsurate în subseturi de 3 până la 8 șoareci, indicate mai jos. Criteriul principal prespecificat a fost funcția motorie pe termen lung (forța de prindere a membrelor anterioare și viteza de alergare); histologia a fost secundară. Investigatorii nu au putut fi în orb față de linia de șoareci; alergarea a fost înregistrată cu o roată automată timp de cinci zile. Datele au fost excluse când un șoarece slăbise, era rănit sau debilitat, sau când o valoare era considerată ciudată.

Rezultate:

Efecte imune în vas. hAMSC au redus proliferarea celulelor T activate de la 90,1% la 59,9% (p sub 0,0001) și au secretat PGE2. Ponderea celulelor CD206-pozitive (M2) a crescut modest, de la 11,3% la 14,2% (p = 0,035), în timp ce celulele M1 nu s-au schimbat. Indometacinul a anulat creșterea CD206, ceea ce indică PGE2 ca mediator.

Tolerabilitate. Greutatea corporală nu a diferit între șoarecii mdx tratați și cei netratați în niciun moment. Nu sunt raportate alte măsuri de siguranță (examinarea organelor, screening pentru tumori, reacție imună la celulele umane).

Termen scurt (vârsta de 12 până la 18 săptămâni, patru doze):

• Creatinkinaza serică, markerul scurgerii din mușchi, a fost mai mică la patru săptămâni după ultima doză (435 ± 79 față de 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 față de 4), dar nu la zece săptămâni (582 față de 700 ng/mL, p = 0,228). Autorii o numesc tranzitorie.
• IL-6 în mușchiul tibial anterior: 10,0 ± 3,8 față de 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 față de 5).
• Forța de prindere la 12 săptămâni: 336,8 ± 21,0 g față de 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; normalizată la greutatea corporală 10,3 față de 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 față de 14).
• Aria macrofagelor (F4/80) în diafragmă: 14,0% față de 19,5% (p = 0,013, n = 4 față de 3). Proporția de macrofage cu markerul M2 CD206 în tibialul anterior a crescut de la 17,6% la 55,5% (p sub 0,0001).
• Celule umane au fost găsite în tibialul anterior la patru săptămâni după tratament, ocupând doar 0,0036% din aria secțiunii, și dispăruseră la zece săptămâni. Distrofina nu a fost detectată, deci celulele nu au reparat defectul de bază.

Termen lung (un an, patru sau șase doze, de obicei cumulate):

• Infiltrarea cu celule mononucleare în tibialul anterior: 9,0% la martori, 7,3% după patru doze, 4,7% după șase; doar grupul cu șase doze a atins semnificația (p = 0,038, n = 4 în fiecare grup tratat față de 14). Nicio diferență în diafragmă.
• Fibre cu nuclei centrali, semn de degenerare și regenerare repetate: 64,3% față de 82,0% (p = 0,014, n = 5 față de 7).
• Fibroza nu a fost redusă în tibialul anterior, diafragmă sau inimă.
• Forța de prindere: 296,5 ± 27,2 g față de 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; normalizată 8,6 față de 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 față de 12). Șoarecii de tip sălbatic au avut 336,4 g, deci șoarecii tratați s-au situat între cele două valori.
• Viteza maximă de alergare nu a fost diferită (21,6 față de 20,5 m/min, p = 0,77). Distanța zilnică de alergare a fost mai mare (3.649 ± 1.025 față de 2.420 ± 788 m/zi, p = 0,028, n = 8 față de 10), la fel ca distanța medie pe minut (18,3 față de 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 față de 5).
• Inima: nicio diferență în morfologia macroscopică, fibroză sau polarizarea macrofagelor, dar mai puțină infiltrare cu celule mononucleare (n = 6 față de 6) și o fracție de scurtare a ventriculului stâng mai mare, 37,0 ± 2,3% față de 33,6% (p = 0,017; tip sălbatic 39,6%). Antetul Tabelului 2 enumeră 8 șoareci tratați, în timp ce nota de subsol și legenda figurii spun 5, o inconsecvență a lucrării însăși.

Concluzii:

Autorii concluzionează că tratamentul sistemic repetat, timpuriu, cu hAMSC a întârziat inflamația și declinul motor la șoarecii mdx, probabil prin polarizarea macrofagelor M2 și nu prin faptul că celulele ar deveni mușchi. Ei sugerează că ar putea fi combinat cu steroizi sau cu terapie genică.

Limitările pe care le declară autorii:

• Boala de inimă la șoarecii mdx este ușoară în comparație cu pacienții, astfel că rezultatele cardiace oferă informații limitate despre oameni. Ei propun confirmarea pe modelul canin.
• Celulele umane au persistat doar scurt timp, iar modul în care factorii secretați produc efecte de lungă durată nu este stabilit; mecanismul rămâne de elucidat.
• Cultivarea și expansiunea pe termen lung a MSC prezintă riscuri de senescență și de modificări cromozomiale, iar capacitatea imunosupresoare variază în funcție de sursa tisulară.
• Din metode: investigatorii nu au fost în orb față de linia de șoareci, unele date au fost excluse prin judecată, iar grupurile pe termen lung au fost mici.

Informații de fond:

Duchenne afectează aproximativ 1 din 3.500 de nașteri de băieți. Steroizii sunt tratamentul antiinflamator standard, dar răspunsurile variază, iar efectele adverse sunt frecvente. Aceeași echipă a raportat anterior că celulele stem din pulpa dentară, administrate intravenos repetat, au menținut activitatea locomotorie la șoareci mdx și la câini distrofici. Autorii notează că MSC administrate intravenos sunt în mare parte blocate în plămâni și mor acolo și că efectul lor imun pare să vină din felul în care fagocitele propriului primitor răspund la celulele care mor. Lucrarea nu conține date despre celule derivate din cordon ombilical și nu menționează niciun studiu la oameni cu celule derivate din amnios pentru Duchenne.